AVT為大家?guī)韼卓钚滦妥⑸浼?jí)陽(yáng)離子脂質(zhì)材料，包括DMG-PEG2000，DOTMA等，本期AVT小編給大家分享一下DOTMA和DOPE在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，好奇的小伙伴速來圍觀！

 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟

 脂質(zhì)體(LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體DOTMA和DPE的混合物(1:1)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方面的轉(zhuǎn)染方法之轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從1-5ug和孵育時(shí)間6h,開始按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間，因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24h為宜。

 細(xì)胞種類：C0-7、BHK、NIH-3T3、Hela和 Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。

 1、操作步驟(方法一)

 1）取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2m1含(1-2)x105個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，37℃、18%C02培養(yǎng)基40%-60%匯合時(shí)。

 2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙烯管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染1個(gè)空細(xì)胞所用的A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋DNA使?jié)舛葹?-10ug,終量100u1。B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋LR,使終濃度為2-50ug,終量100u1輕輕混合A液、B液，室溫中置10-15min,稍后會(huì)岀現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染

 3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2m1不含血清培養(yǎng)基漂洗2次，再加入1m1不含血清培養(yǎng)基

 4)轉(zhuǎn)染：把AB復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)基中，搖勻，置37℃溫箱中6-24h吸除無(wú)血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)

 5)其余處理：如觀察、篩選、檢測(cè)等與其他轉(zhuǎn)染法相同

 6)注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。

 2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟(方法二)

 ●……將細(xì)胞以5x105個(gè)/孔接種于6孔板中培養(yǎng)24h,使其達(dá)到50%-60%板底面積。

 ●……在試管中配制DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物

a、在1m1無(wú)血清DMEM中稀釋PSV1-neo質(zhì)粒DNA或供體DNAb、旋轉(zhuǎn)1s,再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。

c、室溫下放置5-10min,使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。

 ●……棄去細(xì)胞中的舊液，用1m1無(wú)血清DMEM洗細(xì)胞1次后棄去，向每孔中直接加入1m1DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，37℃培養(yǎng)3-5天再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM,繼續(xù)培養(yǎng)14-24h。吸出DEM-DNA-脂質(zhì)體混合物加入新鮮含10%胎牛血清的DMEM,2m1/L,再培養(yǎng)24-48h。用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定

 3、穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

 ●……接種細(xì)胞同前述，細(xì)胞長(zhǎng)至50%

 ●……DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前。

 ●……在每孔中加入1m1含20%胎牛血清的DMEM,37℃培養(yǎng)48h。

 ●……吸出DEM,用G418選擇性培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。

 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)總述

 一、細(xì)胞轉(zhuǎn)染途徑

 轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于物理介導(dǎo)技術(shù)；化學(xué)介導(dǎo)方法很多，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀；

 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù)；生物介導(dǎo)方法，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染，和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)

 1、物理介導(dǎo)

 1）電穿孔法：靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞

 優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率較高

 缺點(diǎn)：需要昂貴的儀器(電穿孔儀)；對(duì)細(xì)胞的損傷較大，每次轉(zhuǎn)染需要

 更多的細(xì)胞和DNA;每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化

 2)顯微注射：借助顯微注射器直接把DNA注入核內(nèi)，使之整合入受體細(xì)胞基因組中

 優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)染效率高，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

 缺點(diǎn)：導(dǎo)入DNA時(shí)需要一個(gè)細(xì)胞一個(gè)細(xì)胞注射，不適合大量轉(zhuǎn)染

 3)基因槍：依賴攜帶了核酸的高速粒子將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)2、化學(xué)介導(dǎo)

 2、化學(xué)介導(dǎo)

 (1)磷酸鈣共沉淀法

 磷酸鈣有利于促進(jìn)外源DNA與靶細(xì)胞表面結(jié)合，氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。

 優(yōu)點(diǎn):能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。

 缺點(diǎn):轉(zhuǎn)染效率低:進(jìn)入細(xì)胞的DNA只有1 %- 5 %可以進(jìn)入細(xì)胞核，其中只有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合,在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。重復(fù)性不佳:pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉淀反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞孵育時(shí)間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。

 (2)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法

 中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹DNA，借助脂質(zhì)膜將DNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體，DNA 并沒有預(yù)先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的 DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。

 優(yōu)點(diǎn):適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;轉(zhuǎn)染效率高，比磷酸鈣法高5-100倍;能夠把DN A和R N A轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定性好，可重復(fù)性高，轉(zhuǎn)染時(shí)好不加血清和抗生素。

 缺點(diǎn):陽(yáng)離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性相對(duì)較高，對(duì)部分細(xì)胞可能會(huì)干擾細(xì)胞的代謝。

 (3)多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)

 DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡 聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30 分鐘-1.5小時(shí)),也可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí))。

 3、生物介導(dǎo)

 病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染:以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)很是常用。

 優(yōu)點(diǎn):整和效率高，可使外源基因在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)，適用于難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞。

 缺點(diǎn):存在潛在的安全危險(xiǎn)性。

 二、理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

 理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小、重復(fù)性好、安全、簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)，是目前轉(zhuǎn)染效率zui高的方法，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是，病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點(diǎn)。

 三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類

 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體.上，不整合到細(xì)胞的染色體上。

 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染: DNA 整合到宿主細(xì)胞的染色體中。

 四、報(bào)告基因

 是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。

 常用的報(bào)告基因系統(tǒng):半乳糖苷酶報(bào)告系統(tǒng)、素酶報(bào)告系統(tǒng)、蛋白報(bào)告系統(tǒng)(GFP)等。

 五、轉(zhuǎn)染方法

 實(shí)驗(yàn)用的是Invitrogen公司的Lipofectamine2000在24孔板轉(zhuǎn)染單層貼壁細(xì)胞。

 1、轉(zhuǎn)染前1天將0.5~2X105細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，并加入500ul不含抗生素的*培養(yǎng)基，以保證轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合達(dá)90~95%。

 2、準(zhǔn)備復(fù)合物

 (1)將0.8ugDNA稀釋于50ul無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中輕輕渾勻。

 (2)將 2ul Lipofectamine2000稀釋于50u1無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)液中，輕輕渾勻，室溫孵育5分。注意:必須在25分內(nèi)進(jìn)行。

 (3) 5 分后將它們混合，并輕輕渾勻，室溫孵育20分。

 3、吸去培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞2次。

 4、將復(fù)合物(總體積100u1)加入培養(yǎng)孔，前后搖動(dòng)培養(yǎng)板使其分布均勻。

 5、將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱孵育4~6h后，可以更換含血清培養(yǎng)液去除復(fù)合物(也可不用)。

 6、24~ 48h后可以觀察轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

 7、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:換含血清培養(yǎng)基24h后將細(xì)胞以1: 10 (或更高比例)傳代，1天后更換篩選培養(yǎng)基篩選。

 8、優(yōu)化:要保證細(xì)胞匯合率達(dá)90~95% (比較高) ; DNA/ Lipofectamine2000比率1: 0.5~1: 5，一般細(xì)胞1: 2~3。